僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

[預期應用]

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清 或其它相關生物液體中待檢測指標含量。

[試劑盒內容]

[標本的采集與保存]

1、 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4^oC過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20^oC或-80^oC保存，但應避免反復凍融。

2、 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8^oC 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20^oC或-80^oC保存，但應避免反復凍融。

3、 組織勻漿：

1） 取適量組織塊，于預冷PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

2） 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL預冷PBS進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2次）。

3） 將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘，留取上清即可檢測。

4、 細胞培養(yǎng)上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20^oC或-80^oC保存，但應避免反復凍融。

注意：

1、 以上標本均需密封保存，4^oC保存應小于1周，-20^oC不應超過1個月，-80^oC不應超過2個月。

2、 標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

3、 標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。

[標本處理]

1、 Uscn,Inc.只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

2、 實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

3、 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。

4、 使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致  ELISA實驗結果偏差。

5、 若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素 較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

6、 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。

7、 建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導致實驗結果偏 差。

[操作步驟]

1、 加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品(見試劑準備2)。空白孔加100μL(見試劑準備第二步最后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37^oC溫育2小時。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37^oC溫育1小時。

4、 棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。

5、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37^oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37^oC避光顯色(反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。

注意：

1、 試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2、 加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。

5、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘觀察一次)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。

6、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、 如果實驗室內濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。